Giống mía KK3 (Saccharum spp.) là giống nhập nội được canh tác rất phổ biến ở Việt Nam với nhiều ưu điểm vượt trội về năng suất và trữ đường. Chọn giống bằng công nghệ gen, bao gồm cả chỉnh sửa gen, là phương pháp chọn giống chính xác, cho phép cải tiến tính trạng của các giống mía phổ biến trong sản xuất như KK3 một cách hiệu quả. Tuy nhiên, yếu tố tiên quyết để thực hiện các phương pháp chọn giống này là phải có một quy trình nuôi cấy in vitro và chuyển gen đạt hiệu suất cao. Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens cho giống mía KK3. Thí nghiệm đã xác định thành phần môi trường tạo mô sẹo tối ưu (2,4-D 3,0 mg/L, casein 500 mg/L và L-proline 500 mg/L) cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đạt 81,1%. Quy trình lây nhiễm Agrobacterium được tối ưu với mật độ vi khuẩn có OD₆₀₀ = 0,05, thời gian lây nhiễm 30 phút và acetosyringone 100 μM cho hiệu suất tiếp nhận DNA đạt 22,22%. Sau chuyển gen, việc sử dụng kết hợp cefotaxim 200 mg/L và vancomycin 200 mg/L đã kiểm soát tỷ lệ mẫu nhiễm Agrobacterium dưới 5% và tỷ lệ mô sẹo sống sót trên 80%. Hygromycin 30 mg/L được xác định là thích hợp để chọn lọc tế bào mía chuyển gen, cho phép tỷ lệ tái sinh chồi đạt 11,1%. Quy trình chuyển gen đã được tối ưu hóa này tạo nền tảng cho việc phát triển các giống mía KK3 cải tiến mang các đặc tính nông học quý sau này.